پایان نامه رایگان درمورد گروه کنترل، تحت درمان، تستوسترون

دانلود پایان نامه

داخل محیط کشت به قطعات کوچک خرد گردید و به مدت30 دقیقه در انکوباتور باقی ماند تا امکان خروج اسپرم ها از اپی دیدیم فراهم آید. لازم به ذکر است که برای جلوگیری از ایجاد شوک حرارتی و آسیب به اسپرم ها، تمام وسایل مورد استفاده و محیط کشت قبل از مصرف و شروع عملیات در انکوباتور 37 درجه قرار داده شدند.
2-8-2) شمارش اسپرمها :
5 میکرولیتر از مایع منی با 95 میکرولیتر محلول رقیق کننده(0.35% فرمالین، 5% بیکربنات سدیم و 0.25% رنگ تریپان بلو ) رقیق گردید. 10 میکرولیتر از سوسپانسیون حاصل بر لام نئوبار منتقل گردید و تعداد اسپرمها در هر میلی لیتر با استفاده از فرمولd ×????? n ×و توسط میکروسکوپ نوری با درشت نمایی ??? برابر محاسبه گردید؛ که n تعداد اسپرمهای شمارش شده و d عکس رقت سوسپانسیون حاوی اسپرم میباشد (Zambrano et al, 2005)
2-8-3) ارزیابی قابلیت زنده ماندن اسپرم ها
برای ارزیابی درصد اسپرمهای مرده، رنگآمیزی ائوزین- نگروزین مورد استفاده قرار گرفت. بدین منظور 20 میکرولیتر از مخلوط ائوزین 0.05% و نگروزین به حجم برابری از سوسپانسیون اسپرم اضافه شد. مبنای تشخیص اسپرمهای مرده در این روش رنگآمیزی بر این اصل استوار است که در اثر آسیب به غشاء پلاسمایی، اسپرمها در برابر رنگ مذکور نفوذپذیر میگردند. لذا آن دسته از اسپرمهایی که هر یک از قطعات سر، گردن و یا دم آنها رنگ گرفته بود به عنوان اسپرمهای مرده در نظر گرفته شدند. تعداد ??? اسپرم برای هر نمونه با درشتنمایی ??? برابر مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاصل در قالب درصد بیان شدند (Wyrobek et al., 1983).
2-8-4) بررسی تحرک اسپرماتوزوئیدها
برای این منظور، ?? میکرولیتر از محلول رقیق شده اسپرم بر روی لام قرار داده شد. شمارش اسپرمهای متحرک با حرکت های سریع(RPFM) ، آهسته (SPFM)، حرکت درجا (RM) و غیر متحرک (ML) در چند میدان دید و در سه مرحله با استفاده از میکروسکوپ نوری و بزرگنمایی 400 صورت گرفت و درصد اسپرمهای متحرک بدست آمد (World Health Organization 2010)
2-8-5) بررسی وضعیت بلوغ هسته اسپرم: رنگ آمیزی آنیلین بلو (AB)
پروتئین هیستون دارای تعداد زیادی اسیدآمینه لیزین میباشد که با رنگهای اسیدی مانند آنیلین بلو واکنش میدهد و آبی رنگ میشود. بنابراین اسپرمهایی که پس از تراکم در کروماتین خود، دارای هیستونهای اضافی باشند با این رنگ آمیزی مشخص میشوند. پس از تهیه اسمیر از هر نمونه حیوانی و خشک شدن در هوا، مرحله فیکس شدن نمونهها توسط فیکساتیو گلوتارآلدئید ?% در بافر به مدت ?? دقیقه انجام شد. در مرحله بعد نمونهها توسط محلول ?% آنیلین بلو در اسید استیک ?% (?/?=PH) به مدت ? دقیقه رنگ آمیزی شدند. پس از شستشو با آب مقطر، لامها با میکروسکوپ نوری و عدسی 100× مورد بررسی قرار داده و با شمارش ??? اسپرم، درصد اسپرم بیرنگ (نابالغ) تعیین گردید. (Hamadeh et al., 2001)

2-8-6) بررسی DNA شکسته و یا تک رشته ای: رنگ آمیزی آکریدین اورانژ (AO)
رنگ فلورسنت، جهت تمایز DNA دو رشته ای سالم از DNA تک رشته ای ناسالم و دناتوره بکار میرود. AO با DNA دو رشته ای سالم زیر میکروسکوپ فلورسنت سبزرنگ و با DNA تک رشته ای دناتوره زرد تا قرمز رنگ می شود( 11 Varghese et al.,20). پس از تهیه اسمیر از هر نمونه و خشک کردن در هوا، فیکس شدن نمونه ها توسط محلول کارنوی(متانول: اسید استیک:1:3 ) به مدت حداقل 2ساعت صورت گرفت و سپس رنگ AO تازه با غلظت 19/0 میلی گرم در بافر سیترات فسفات به مدت 10 دقیقه برای رنگ آمیزی لام ها بکار رفت. پس از شستشو توسط آب مقطر، لام ها توسط میکروسکوپ فلورسنت و در یک محیط تاریک با فیلتر nm 460 بررسی شدند. برای هر پروتکل 400 اسپرم مورد بررسی قرار گرفت. ( 08 Rezvanfar et al, 20).

2-9) سنجش فاکتورهای بیوشیمیایی
2-9-1) روش اندازه گیری مالون دی آلدئید :
برای این منظور یک گرم از بافت بیضه در بافر فسفات صفر درجه سانتیگراد 0.05 مولار با 7.4=ph و با غلطت 10 درصد (w/v) هموژنیژه گردید و سپس محلولهای حاصل با دور g 1000 سانتریفیوژ گردید. مایع رویی جهت میزان تولید محصولات پراکسیداسیون لیپید مورد استفاده قرار گرفت. درجه پراکسیداسیون لیپیدها بر مبنای میزان تشکیل مالون دی آلدئید (MDA) تعیین میگردد. مالون دی آلدئید محصول نهایی پراکسیداسیون اسیدهای چرب است و با تیوباربیتوییک اسید (TBA)وارد واکنش شده و کمپلکس رنگی ایجاد میکند. اساس روش اندازه گیری اسپکتروفتومتریک رنگ ایجاد شده بر اثر واکنش TBA با MDA میباشد. بدین منظور300 میکرولیتر تری کلریک اسید 10 درصد به 150 میکرولیتراز محلول رویی نمونه سانتریفیوژ شده اضافه شده و به مدت 10 دقیقه با دور g 1000 در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفوژگردید. 300 میکرولیتر از محلول رویی به لوله آزمایش منتقل و با 300 میکرولیتر از تیوباربیتوریک اسید0.67% در دمای 100 درجه سانتیگراد برای 25 دقیقه انکوبه شد.5 دقیقه بعد از خنک شدن محلول ، رنگ صورتی ناشی از واکنش TBA-MDA ظاهر و به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج 535 نانومتر ارزیابی گردید. غلظت MDA بصورت nmol/g wet tissue بیان شد(Hosseinzade et al., 2005).

مطلب مشابه :  منابع پایان نامه ارشد با موضوعschema، social، knowledge، learning

2-9-2) روش اندازه گیری قدرت آنتی اکسیدانی کل(FRAP):
قدرت آنتی اکسیدانی کل بافت بیضه با اندازه گیری قدرت احیاء کنندگی/ آنتی اکسیدانی فریک (FRAP:Ferric Antioxidant Power) محاسبه گردید. در روز آنالیز بافت ها در محلول KCL سرد (5/1%) برای گرفتن 10% سوسپانسیون هموژنی، هموژنیزه شده و برای ارزیابی بیوشیمیایی استفاده شدند.
ارزیابی FRAP تغییر در جذب 593 نانومتر را بواسطه تشکیل ترکیب Fen- Tripyridyltriazine آبی رنگ از Fem اکسید شده بی رنگ توسط عمل آنتی اکسیدانت های دهنده الکترون را ا
ندازه میگیرد (Iris& Strain, 1996).
معرف FRAP شامل :
محلول1: شامل بافر استات 300 میلی مولار (g3/1 سدیم استات +ml16 اسید استیک در یک لیتر آب مقطر6/3PH: )
محلول2: TPTZ 10 میلی مولار در HCL 40 میلی مولار
محلول3: Fecl3.6H2O 20 میلی مولار در آب مقطر که این 3 محلول تهیه شده به نسبت 1:1:10 با هم مخلوط گردیدند. محلول معرف شامل ml25 محلول 1، ml2.5 محلول 2 و ml5/2 محلول 3 می باشد. محلول معرف باید همیشه به تازگی تهیه شود. 50 میکرولیتر محلول هموژنیزه بافت به 5/1 میلی لیتر محلول تازه آماده شده و از قبل گرم شده(37 درجه سانتی گراد) معرف FRAP در لوله آزمایش اضافه و سپس در 37 درجه ساتی گراد برای 10 دقیقه انکوبه گردید. جذب کمپلکس آبی رنگ علیه محلول بلانک در 593 نانومتر خوانده میشود. واکنش برای 5 دقیقه بررسی میشود. معرف بلانک شامل5/1 میلی لیتر معرف FRAP + 50 میکرولیتر آب مقطر می باشد. محلول استاندارد Fen در رنج 100 به 1000 میلی مول از فروس سولفات Feso4-7H2O در آب مقطر آماده می شود. داده ها بر اساس میلی مول یون فریک کاهش یافته به فرم فروس در لیتر بیان می شود (Iris& Strain, 1996; Hosseinzade et al, 2005).
2-9-3) روش اندازه گیری فعالیت آنزیم کاتالاز:
فعالیت کاتالاز بر اساس توانایی آن در تجزیه H2O2 در بافت هموژنیزه شده بیضه تعیین گردید. تجزیهH2O2 با کاهش جذب در طیف جذبی 240 نانومتر قابل بررسی می باشد. تفاوت در جذب در واحد زمان معادل مقدار فعالیت کاتالاز است. برای این منظور از پراکسید هیدروژن 30 میلی مولار به عنوان سوبسترا و از بافر فسفات 50 میلی مولار با 7.4=PH به عنوان جایگزین سوبسترا در محلول بلانک استفاده شد. محلول سنجش محتوی 2 میلی لیتر محلول هموژنای بافتی و 1 میلی لیتر محلول پراکسید هیدروژن میباشد. واکنش با افزودن H2O2 شروع شد وکاهش در جذب به کمک اسپکتروفتومتر در طول موج 240 نانومتر به مدت 30 ثانیه بررسی و در پایان مقادیر بر حسب U/g tissue بیان گردید(Havir &Mellate, 1987).
2-10) اندازه گیری تستوسترون سرمی
برای اندازه گیری غلظت تستوسترون سرمی از روش الایزا استفاده گردید. این کار با کمک دستگاه الایزا ریدر Staff fax 3200 ساخت کمپانی آمریکا Avernes و کیت شرکت مونوباین انجام گردید.
2-11) مطالعات هیستوشیمیایی بیضه
2-11-1) رنگ آمیزی آهن وایگرت
به منظور مطالعه بافت بیضه، روش رنگ آمیزی آهن وایگرت مورد استفاده قرار گرفت. در این روش رشته های کلاژن به رنگ قرمز، عضلات و پوشش های شاخی به رنگ زرد و هسته ها به رنگ آبی تا سیاه قابل مشاهده هستند.
2-11) آنالیز و تحلیل داده ها
محاسبه آماری با استفاده از نرم افزار آماری SPSS نسخه 19 و با استفاده از روش آنالیز One-way ANOVA به طرقDuncan و Tukey انجام گرفت. (p0.05) به عنوان معیار معنی دار بودن اختلاف ها در نظر گرفته شد.

علائم اختصاری بکار برده شده در نمودارهای مربوط به گروه های تحت تیمار
CO: گروه کنترل
RJ: گروه دریافت کننده ژل رویال
BL: گروه دریافت کننده داروی بلئومایسین
RJ+BL: گروه ترکیبی(بلئومایسین + ژل رویال)
*: اختلاف معنی دار با گروه کنترل (p0.05)
#: اختلاف معنی دار با گروه داروی بلئومایسین(p0.05)

3-1) نتایج حاصل از ارزیابی خصوصیات اسپرم

3-1-1) نتایج حاصل از بررسی تعداد اسپرم
همانگونه که در نمودار 3-1 مشاهده میشود تجویز داروی بلئومایسین در موشهای صحرایی نر کاهش معنی داری (p0.05) را در تعداد اسپرم نسبت به گروه کنترل و ژل رویال نشان داده است. تیمار همزمان ژل رویال و بلئومایسین باعث افزایش معنی دار تعداد اسپرم در سطح p0.05 گردید، به طوری که در پایان دوره تیمار تعداد اسپرم ها در این گروه(BL+RJ) از نظر آماری هیچ تفاوت معنی داری (p0.05 ) با گروه کنترل رویال نداشت. همانگونه که در نمودار مشهود است از نظر آماری هیچ اختلاف معنی داری میان گروه کنترل و گروه دریافت کننده ژل رویال وجود ندارد. (نمودار3-1 و جدول 3-2).

مطلب مشابه :  پایان نامه ارشد رایگان دربارهعملکرد سازمان

نمودار 3-1: مقایسه میانگین تعداد اسپرم ها در گروه های تحت تیمار(* اختلاف معنی دار با گروه کنترل و گروه ژل رویال ( p0.05)؛ # اختلاف معنی دار با گروه داروی بلئومایسین(p0.05))

3-1-2) نتایج حاصل از مطالعه میزان اسپرم زنده
نمودار3-2 نشان می دهد که درصد اسپرم های زنده در گروه تیمار شده با داروی بلئومایسین به طور معنی داری نسبت به گروه کنترل ( p0.05) کاهش یافته است. تجویز ژل رویال توأم با داروی بلئومایسین به صورت معنی دار (p0.05) نسبت به گروهی که تنها بلئومایسین را دریافت نموده بودند، در افزایش قدرت زیست اسپرم ها موثر واقع شد(جدول2-3 ). هیچ تفاوت معنی داری میان گروه کنترل و گروه دریافت کننده ژل رویال مشاهده نشد (تصویر3-1). لازم به ذکر است که به منظور ارزیابی میزان اسپرم های مرده رنگ آمیزی ائورین- نگروزین مورد استفاده قرار گرفت

تصویر 3-1: اسپرم زنده(1) با سر بدون رنگ و اسپرم مرده با سر صورتی(2)، رنگ آمیزی ائورین(E&N ×400).

نمودار3-2 درصد اسپرم های زنده در گروه های تحت تیمار(* اختلاف معنی دار با گروه کنترل و گروه ژل رویال ( p0.05)، # اختلاف معنی دار با گروه داروی بلئومایسین(p0.05))

3-1-3)نتایج حاصل از مطالعه میزان تحرک اسپرم
بررسی های صورت گرفته در گروه های مختلف آزمایشی نشان داد که میزان تحرک سریع اسپرم ها(RPFM) در گروه تحت درمان با داروی بلئومایسین کاهش معنی داری (p0.05) نسبت به گروه کنترل و ژل رویال داشت در حالی که اسپرم های بدون حرکت(ML) و اسپرم ها با حرکات آهسته (SPFM) در این گروه نسبت به گروه کنت
رل افزایش معنی داری یافته بود.هیچ تفاوت معنی داری (p0.05) میان گروه کنترل و گروه دریافت کننده ژل رویال مشاهده نشد. تیمار با ژل رویال متعاقب تجویز داروی بلئومایسین در مقایسه با گروهی که تنها داروی بلئومایسین را دریافت کرده بودند حرکت سریع اسپرم (RPFM) را به طور معنی دار (p0.05) نسبت به گروه داروی بلئومایسین، بهبود (افزایش) و حرکت آهسته (SPFM) را به طور معنی دار (p0.05) نسبت به گروه بلئومایسین کاهش بخشید.
درصد اسپرم های بدون حرکت در گروهی که همزمان با داروی بلئومایسین ، ژل رویال را نیز دریافت نموده (BL+RJ) با گروه کنترل تفاوت معنی دار (p0.05) نشان داد. تفاوت چندانی در میزان اسپرم ها با حرکات درجا (RM) ما بین گروه های مختلف آزمایشی مشاهده نشد(جدول3-1، نمودار3-3 ).

درصد اسپرم با حرکت سریع
درصد اسپرم با حرکت آهسته
درصد اسپرم با حرکت درجا
درصد اسپرم بدون حرکت

63.50±1.18
17.53±0.67
11.23±0/60
7.73±.37
کنترل
62.43±1.15
16.83±0.33
11.13±0.58
10.60±0.30
ژل رویال
51.63±0.50*
23.86±0.66*
12.03±0.52
12.46±0.73*
بلئومایسین
59.80±2.36
16.13±2.03
12.50±1.50
11.56±0.58
بلئومایسین+ ژل رویال

جدول3-1: درصد انواع تحرک اسپرم ها در گروه های تحت تیمار(* اختلاف معنی دار با گروه کنترل ( p0.05)(

نمودار3-3: درصد تحرک اسپرم ها در گروه های تحت تیمار(* اختلاف معنی دار با گروه کنترل ( p0.05)، # اختلاف معنی دار با گروه داروی بلئومایسین(p0.05))
3-1-4) نتایج بررسی وضعیت بلوغ هسته اسپرم
این مطالعه نشان داد درصد اسپرم های نابالغ در گروه تحت درمان با داروی بلئومایسین، دارای اختلاف معنی داری در سطح p0.05 با گروه کنترل و گروه دریافت کننده ژل رویال می باشد. با مصرف همزمان ژل رویال به عنوان آنتی اکسیدان با داروی بلئومایسین در گروه ترکیبی(BL+RJ) درصد اسپرم های نابالغ نسبت به گروهی که بلئومایسین را به تنهایی دریافت نموده بودند(BL)، کاهش یافت. اما با این وجود درصد اسپرم های نابالغ در این گروه (BL+RJ) از نظر آماری اختلاف معنی داری را در سطح p0.05 نسبت به گروه ژل رویال و کنترل نشان داد(نمودار3-4، جدول2-3).

شکل3-2: اسپرم بالغ با سر روشن رنگ نگرفته (شماره1)، اسپرم بالغ با سر تیره(شماره 2)؛ رنگ آمیزی آنیلین بلو (×400).

نمودار 3-4: نتایج حاصل از شمارش اسپرم های نابالغ(* اختلاف معنی دار با گروه کنترل و ژل رویال ( p0.05)، # اختلاف معنی دار با گروه داروی بلئومایسین(p0.05))
3-1-5) نتایج حاصل از مطالعه DNA اسپرم
نتایج حاصل از رنگ آمیزی آکریدین اورانژ اسپرم در گروه تحت درمان با داروی بلئومایسین نشان داد که درصد اسپرم ها با DNA آسیب دیده در این گروه ، به طور معنی داری در سطح p0.05 نسبت به گروه کنترل و گروه ژل رویال افزایش یافته است. با مصرف همزمان ژل رویال با داروی بلئومایسین در گروه ترکیبی(BL+RJ) درصد آسیب نسبت به

دیدگاهتان را بنویسید